Como fazer iniciadores oligonucleótidos para PCR

Para a reacção em cadeia da polimerase para amplificar o ADN correctamente, são necessários dois iniciadores adequadamente efectuadas, ou cadeias curtas de nucleótidos que são complementares com a primeira parte do segmento de ADN que está a ser copiado. O PCR é utilizado para uma variedade de aplicações que vão desde a aplicação da lei para a engenharia genética. Trata-se de tomar uma amostra de ADN de cadeia dupla, o qual funde a sua quebra-se o ADN em cadeias separadas, anexando os iniciadores para as cadeias simples, e depois estendendo-se os iniciadores para formar dois fragmentos de DNA de cadeia dupla. Este processo é repetido de modo a obter uma amostra várias vezes a concentração do original.

O primer forward que você estará fazendo deve corresponder-se com o DNA no lado oposto, ou fita complementar. Em outras palavras, ele deve ser constituído pelos primeiros nucleotídeos de sua seqüência de interesse. O iniciador inverso tem para se ligar ao fim do seu gene de interesse e imitar a sua cadeia complementar.

Usando um processador de texto ou programa mais especializado para DNA, olhe para a sequência de DNA que se deseja ampliar. Tome nota das primeiras 18-24 pares de bases e os últimos 18-24 pares de bases. Eles não devem ser encontrados em outros lugares em sua amostra de DNA, que pode ser comum para as áreas que se repetem. Se isso acontecer, você vai acabar com a ligação a várias áreas de sua cartilha dentro de sua amostra e resultados da PCR de comprimento variável.
Anote os primeiros e últimos segmentos de DNA que você estava olhando na primeira etapa. Por exemplo, digamos que a seqüência começando era ATGGAATTCACGATCGATCGT ea última foi GGGTGCGAACACGGACTTAG. Neste exemplo, estamos priming para o início e fim de um determinado gene.
Tomar a primeira 18-24 pares de bases de sequência (no exemplo, é ATGGAATTCACGATCGATCGT) e inseri-lo num outro documento para fazer o iniciador directo. Salve-o com o nome da região que estão preparando para e do fato de que é um primer para a frente.
Anotar os últimos 18-24 pares de bases da sequência de interesse (GGGTGCGAACACGGACTTAG no exemplo) para criar o iniciador inverso. Escrever os nucleótidos complementares para a sequência que representa o outro lado. Cada uma das quatro bases de um pares de nucleótidos com apenas uma outra base: adenina (A) com timina (T) e citosina (C) com guanina (G). Depois de ter a outra cadeia complementar, que deseja inverter a ordem de todos os nucleótidos da cadeia reescrevendo-o na direcção oposta. Quando isso for concluído, tome a sua seqüência recém complementadas e invertida e salve-o em um documento devidamente rotulados.
Ir para o site do seu fornecedor e insira a seqüência com a conta relevante faturamento (geralmente ligado a um laboratório), concentração e quaisquer outras modificações especiais. Faça seu pedido.

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