Como posso saber se o ADN Clonagem e Ligação são bem sucedidos?
Para determinar como uma das funções dos genes numa célula por transfecção de um gene sobre-expressar a ele, que é crítico para assegurar o ácido (ADN) clonagem e ligao passo desoxirribonucleico envolvendo um vector apropriado é bem sucedido. Se o passo de ligação não foi bem sucedida, ou se inserir DNA não está inserido na orientação correta, os dados serão uninterpretable, e será impossível determinar como o gene funciona na célula.
Conteúdo
Coisas que você precisa
- Os iniciadores de PCR
- gel de agarose a 3 por cento
- plasmídeo sem ligadura
- O plasmídeo mais o ADN de inserção
- enzimas de restrição apropriada para inserção especial de consumo
- glicerol contendo tampão de carga 4x
- O brometo de etídio ou outro agente intercalante de ADN
Criar reacção em cadeia da polimerase (PCR) para a sua inserção que incorpora um local de restrição de novo para o iniciador. Por exemplo, o iniciador de PCR é de 18 nucleótidos de longa ao montante ou cinco plica (5’ ) final adicionar a sequência canónica para uma enzima de restrição que não está já no interior do plasmídeo. Isto irá permitir a clonagem unidireccional do inserto no plasmídeo. As sequências de sítios de restrição podem ser encontradas em sites de empresas que vendem as enzimas, tais como Current Protocols in Molecular Biology e New England Biolab, que estão ligadas na seção Recursos.
Determinar o tamanho do produto de PCR. Para fazer isso, executar-se uma alíquota do produto de PCR num gel de agarose a 3 por cento, juntamente com um marcador de peso molecular apropriado. Isso também determina se ou não apenas um produto foi amplificado.
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Sequenciar o produto de PCR.
Introduzir sequência para a ferramenta de busca de alinhamento local de base (BLAST, BLASTN) para assegurar que apenas o gene pretendido foi amplificado. A ferramenta de pesquisa está ligada na seção Recursos.
Digerir o plasmídeo além de inserção utilizando as enzimas de restrição apropriadas. Faça isso depois que o produto PCR foi verificada e ligado no vector apropriado. Siga as instruções para o tempo de digestão e de temperatura fornecida com as enzimas.
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Executar uma aliquota do plasmídeo restringido diluído em tampão de carga 4x contendo brometo de etídio ou outro agente intercalante de ADN para visualizar o ADN num gel de agarose. Se o inserto foi correctamente ligado ao plasmídeo, dois fragmentos deve ser visível no gel.
Sequenciar o inserto para assegurar que foi incorporado na orientao correcta. Fazê-lo cortando o plasmídeo mais inserir utilizando enzimas de restrição que se encontram a montante e a jusante da inserção. iniciadores de sequenciação desenho que incorporam alguns dos plasmídeos e inserir juntos no mesmo iniciador. Isso vai lhe dizer definitivamente sobre a inserção ea orientação.
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