Os componentes básicos de um HPLC

A fim de ser injectada na coluna de HPLC, uma amostra deve ser primeiro dissolvido num solvente polar líquido, de preferência um com espectros de HPLC conhecidos para que os seus dados pode ser distinguida a partir da amostra de. A solução líquida contendo a amostra é colocado no instrumento e é enviada para a coluna. A localização real do local de injecção depende da marca de instrumentos. Na maioria dos casos, o processo de injecção é automatizado, mas em alguns casos, um técnico de laboratório deve injectar a amostra, utilizando uma agulha de seringa de pequeno porte.

O componente de bomba da unidade de HPLC é necessário porque fornece a pressão que impele a amostra através da coluna. força da bomba varia, mas um potente pode-se produzir uma pressão de até 6000 psi, ou de libras por polegada quadrada, o qual é aplicado após a amostra é injectada. Isto permite que a amostra passe através da coluna de forma mais rápida e eficiente do que se fosse para escorrer através do uso de apenas a força da gravidade.

O aumento da velocidade de uma amostra passou através da coluna por uma bomba permite o uso de um diferente tipo de coluna do que as utilizadas em cromatografia líquida simples. O material de embalagem na coluna pode ter um tamanho de partículas muito menor, o que aumenta a área de superfície e, por conseguinte, ajuda interacções da amostra com a coluna. A maioria das colunas de HPLC trabalhar através de polaridade. A amostra é dissolvida num solvente polar, e a coluna é constituída de hidrocarbonetos em grande parte não-polares. As partes polares da molécula da amostra passe através da coluna muito rapidamente porque eles estão a interagir principalmente com o solvente, ao passo que os componentes não polares da amostra permanecer na coluna, formando interacções fracas com os componentes de coluna. Portanto, os componentes da amostra vir a sair da coluna, a fim de mais polar para a maior parte não-polar.

Os detectores também variar com base no tipo de instrumento de HPLC sendo utilizados. No entanto, a maioria funcionam da mesma maneira básica. Uma fonte de luz ultravioleta brilha sobre os componentes da amostra separadas à medida que saem da coluna. A maioria dos compostos orgânicos absorver uma certa quantidade de luz, de modo que à medida que passam pelo feixe de luz aplicada, um detector pode escolher-se a quantidade de luz é absorvida. O detector também registra o tempo de retenção dos componentes com base na ordem em que eles saem da coluna. Esta saída pode então ser analisada com base na área do pico para determinar a natureza exata dos componentes da amostra.